Un microscope confocal est un microscope optique qui a la propriété de réaliser des images de très faible profondeur de champ (environ 400 nm) appelées « sections optiques ». En positionnant le plan focal de l’objectif à différents niveaux de profondeur dans l’échantillon, il est possible de réaliser des séries d’images à partir desquelles on peut obtenir une représentation tridimensionnelle de l’objet.

     En microscopie optique à champ large, pour qu'une image soit nette, il faut que l'objet soit dans le plan focal du système optique. Lorsqu'un objet est épais, présente un relief important, ou bien lorsqu'il est incliné par rapport à l'objectif, seule une partie de l'objet est nette dans l’image.

     De plus, plus le grossissement est élevé, plus cette profondeur est faible, ce qui empêche d'avoir une image nette sur la totalité d'un objet un peu étendu. Ceci est particulièrement ennuyeux pour les objets allongés comme les nerfs; ils sont donc flous sur une partie de leur trajet quelle que soit l'habilité du préparateur.

     Pour résoudre ce problème, on éclaire la surface non plus par un faisceau de lumière blanche, mais par un rayon laser (ou une autre source monochromatique), concentré par une lentille, et on positionne une sténopée (pinhole en anglais) devant le détecteur, dans un plan focal conjugué au plan focal de l’objectif (plans confocaux). De cette manière, seuls les photons provenant du plan focal passent la sténopée et participent à la formation de l’image, d'où le nom « confocal » (synonyme de monofocal).

     La lumière provenant des plans adjacents (floue) est arrêtée par les bords du trou. Il est ainsi possible d'obtenir une coupe optique nette correspondant uniquement au plan focal. En faisant varier ce plan on obtient une succession de coupes donnant des informations nettes et précises dans les trois dimensions de l'objet observé.

     Prenons le schéma du chemin optique dans le montage Raman du type LabRam HR800 confocal :

     Le faisceau violet est le faisceau laser qui est envoyé dans le plan focal de l'échantillon grâce au miroir à 90° (de toute petite taille) et aux lentilles de l'objectif. Le faisceau Raman, en retour, est composé de rayons lumineux situés dans la zone matérialisée par les faisceaux bleu et jaune. Ce faisceau "multicolore" passe à travers les lentilles de l'objectif puis à travers le filtre de Rayleigh (filtre Notch super Plus) et est collimaté vers le trou confocal (confocal pinhole) avant d'arrivé sur la fente d'entrée du monochromateur qui va procédé à la dispersion spatiale du faisceau Raman polychromatique.

     Au niveau du trou confocal, on voit que par construction, le faisceau bleu est bloqué et le faisceau jaune passe. Le faisceau bleu trouvait son origine hors du plan focal au niveau de l'échantillon, par contre, le faisceau jaune est le faisceau juste dans le plan focal (z = 0 si on est mis au point à la surface de l'échantillon).

     Grâce à l'élimination par le trou confocal des faisceaux hors du plan focal, on améliore la résolution axiale (en z). Dans un matériau transparent et avec un laser vert, elle est d'environ 2.4 µm dans les conditions usuelles. Néanmoins, si le signal est intense et que le diamètre du trou confocal peut être abaisser à 20 µm, la résolution axiale peut être inférieure à 0.5 µm